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    HBV分析

    微生物组分析
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    • A
      anneng 最后由 anneng 编辑

      二代数据分析过程
      对比分型
      使用比对 直接将reads比对到参考基因组上 然后进行统计

      blast分型
      使用blast直接和hdvdb进行对比查询（ncbi自己的分型工具对查询序列进行了分段 类似kmer 我们一般拿到的reads双端文件 感觉和这种分段很类似 可以直接查询 也不用组装了）ncbi宣称好处是可以找出“重组”过的病毒类型 即一个病毒由多个病毒拼接而成 这种情况很难和混合样本（一个样本有多个分型的感染）区分开
      e76e0106-c88e-4c78-80c6-d707708cc59b-image.png
      直接使用reads 来分型 可以参考这个文章
      https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/pmc/articles/PMC4382110/
      进化树方式进行分型：
      1.fastp ：质控和预处理
      2.去接头（可选）
      3.过滤：碱基质量
      4.比对：bowtie2、bwa-mem 和通用株X02763
      5.排序、去重：Samtools
      6.生成一致性序列：CliqueSNV
      7.多序列比对：和hdvdb数据库进行多序列比对（blast方法不需要这个步骤 由于病毒的变化很多 很可能在多序列比对时无法有效对齐）
      8.构建进化树：MEGA 7 maximum-likelihood方法 该步骤就可以得到每个样本的分型

      构建单倍型 Haplotype construction
      1.比对：和该样本的对应分型参考序列进行比对
      bowtie2's very-sensitive-local
      2.去重：Sambamba
      3.构建单倍型：CliqueSNV

      diversity analysis
      香农商Shannon entropy (Sn)：
      S = −pilnpi, where pi is the frequency of each haplotype in the viral quasispecies population
      genetic diversity (D) ：MEGA X v10.1.8 genetic distance of the haplotypes
      病毒进化率 viral evolutionary rates：MEGA 7 HKY substitution model 、BEAST v2.6.3、Tracer

      统计分析
      SPSS

      突变分析
      Samtools mpileup：

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      • A
        anneng 最后由 编辑

        https://www.rivm.nl/mpf/typingtool/hev/introduction
        一个在线的hev的分型工具 有参考报告

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        • A
          anneng 最后由 编辑

          https://livedataoxford.shinyapps.io/1510659619-3Xkoe2NKkKJ7Drg/
          一个shinyapps 展示了非洲的HBV耐药性
          https://github.com/martinjhnhadley/hbv-alignment-viz

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          • A
            anneng 最后由 编辑

            https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11230757/
            Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region
            HBV耐药性突变的命名规则 rtL180M

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            • A
              anneng 最后由 编辑

              https://sci-hub.st/10.1053/j.gastro.2009.08.063

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              • A
                anneng 最后由 anneng 编辑

                https://jbiomedsci.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12929-018-0442-4
                Applications of next-generation sequencing analysis for the detection of hepatocellular carcinoma-associated hepatitis B virus mutations
                这篇文章分析了HBV突变和肝癌的相关性
                1.对于组装 文章提到有参组装更好 相对de novo 组装而言 毕竟illumina的reads比较短

                2.文章里面提到了一个sample-specific 参考序列、同基因型的参考序列、其他不兼容参考序列对假阳性的影响。
                0b892b14-29b7-4e7f-8349-f0a7309cc54e-image.png
                这个文章很水 没有提到生信是怎么做的

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                • A
                  anneng 最后由 编辑

                  https://hivdb.stanford.edu/HBV/releaseNotes/

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                  • A
                    anneng 最后由 anneng 编辑

                    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/pmc/articles/PMC4382110/

                    ac0d250c-63dc-4b2f-b3ce-c3e9b93f8fdd-image.png

                    直接用reads 在进化树上进行分型 并且能进行混合样本的分型

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                    • A
                      anneng 最后由 anneng 编辑

                      四医大HBV分析记录
                      1.使用bbmerge合并R1 R2 下面脚本的意思是使用find找到样本名称 然后使用这个样本名称传递给parallel并发处理

                      find ../all_data/*_L001_R1_001.fastq.gz | sed 's/_L001_R1_001.fastq.gz$//' | parallel 'bbmerge.sh in1=../all_data/{}_L001_R1_001.fastq.gz in2=../all_data/{}_L001_R2_001.fastq.gz out={}.fastq  outu1={}.R1.umerged outu2={}.R2.unmerged'

                      发现327个样本中 有几个样本 R1 和 R2 的数量不一致 针对这些样本 使用spades进行组装 取最长的序列进行第二步
                      因为涉及到组装 无法进行混合样品的分析 把这些样本当作单样本处理
                      将所有的fastq转成fasta(blast只识别fasta)

                      parallel 'seqtk seq -a {}> {.}.fasta' ::: *.fastq

                      2.使用blast 对样本中的序列进行分型 得到每个样本中各种分型的序列数量
                      构建blast数据库
                      从hbvdb下载的参考序列 有一个类别是RF 例如 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/EU871985.1?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=Z8DW1MY8016 这个序列 NCBI没有标识类型 hbvdb将其注释为了BC重组型 我们当前先把这种RF的去掉

                      makeblastdb -in all_hbvdb_Genomes.fas -dbtype nucl

                      blastn -task blastn -max_target_seqs 1 -query ../0-merging-pe/100_S42.fasta -db ../hbvdb/all_hbvdb_Genomes.fas -num_threads 10 -out 100_S42.m8 -outfmt 6

                      nohup bash -c "find ../0-merging-pe/*.fasta | sed 's/.fasta$//' |  parallel --joblog ./logs -j40 blastn -task blastn -max_target_seqs 1 -query ../0-merging-pe/{}.fasta -db ../hbvdb/A-H/HBV_A_H.fas -out {/}.m8 -outfmt 6 " &

                      3.比对

                      nohup bash -c "find ../all_data/*_L001_R1_001.fastq.gz | sed 's/_L001_R1_001.fastq.gz$//' | parallel 'bwa mem -M AB033556_hbc_type_C.fasta {}_L001_R1_001.fastq.gz {}_L001_R2_001.fastq.gz > {/}.sam' " &

                      nohup parallel "samtools view -bF 4 {} > {/.}.bam" ::: ./sam/*.sam &
parallel samtools sort {} -o {.}.sorted.bam ::: *.bam

                      4.call

                      nohup parallel "lofreq indelqual {} --dindel -f ../3-mapping/AB033556_hbc_type_C.fasta -o {/.}.sorted.dindel.bam " ::: ../3-mapping/bam/*.sorted.bam &

nohup parallel "lofreq call {} --call-indels -f ../3-mapping/AB033556_hbc_type_C.fasta -o {/.}.vcf " ::: *.bam &

                      5.分析单倍型

                      find /ceph_disk2/siyida_327_sample/3-mapping/sam/ -name "*.sam" -exec basename \{} .sam \; | sed 's/.sam$//' |parallel 'java -jar clique-snv.jar -m snv-illumina -in /ceph_disk2/siyida_327_sample/3-mapping/sam/{}.sam'
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                      • A
                        anneng 最后由 编辑

                        spades的组装

                        /home/bioinfo/miniconda2/envs/assembly/bin/spades.py      -1      /ceph_disk3/hbv/HBV_illumina/106/106_S46_L001_R1_001.fastq      -2      /ceph_disk3/hbv/HBV_illumina/106/106_S46_L001_R2_001.fastq      -o      /ceph_disk3/hbv/HBV_illumina/106/spades
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                        • A
                          anneng 最后由 编辑

                          https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1386653218300970
                          Frequency of hepatitis B surface antigen variants (HBsAg) in hepatitis B virus genotype B and C infected East- and Southeast Asian patients: Detection by the Elecsys® HBsAg II assay

                          e87934f0-1292-4109-b492-1e24fcf01653-image.png

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                          • A
                            anneng 最后由 编辑

                            https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0172101
                            Ultra-deep sequencing reveals high prevalence and broad structural diversity of hepatitis B surface antigen mutations in a global population
                            https://github.com/spabinger/HBV_data_publication_2016_07
                            an MHR variant was defined as a nucleotide sequence change in the S gene region (encoding amino acids 99 to 170) with an allele frequency >5% (in both sequencing directions) and at least 3 variant reads present on the forward as well as on the reverse strand.
                            1f045d8c-a618-4d93-8f61-a267962eef2a-image.png

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                            • A
                              anneng 最后由 编辑

                              https://sci-hub.st/10.1159/000361076
                              Hepatitis B Virus Drug Resistance Tools:
                              One Sequence, Two Predictions
                              www.genafor.org/services.php

                              HIV-GRADE HBV

                              文章提到了一些工具 用于分型、耐药、免疫逃逸的分析
                              d118672c-2903-407f-9be2-c9a5e2882cfd-image.png

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                              • A
                                anneng 最后由 编辑

                                Genetic Diversity of Hepatitis B Virus
                                Strains Derived Worldwide: Genotypes,
                                Subgenotypes, and HBsAg Subtypes

                                https://sci-hub.st/10.1159/000080872
                                对HBV进行进化树分析 里面也提到血清型和基因型之间的复杂的对应关系。
                                涉及的软件：
                                DNADIST and NEIGHBOR from the Phylip program package version 3.53

                                PUZZLE

                                Bootstrap on 1,000 replicas was performed with SEQBOOT, DNADIST, NEIGHBOR, and CONSENSE from the Phylip package.

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                                • A
                                  anneng 最后由 anneng 编辑

                                  Global Occurrence of Clinically Relevant Hepatitis B Virus
                                  viruses-12-01344-v3.pdf

                                  从蛋白序列预测血清型
                                  01c98519-63c9-4919-932c-3d39f5266476-image.png

                                  7f70201a-8ea6-441e-909d-c2be7f034a76-image.png

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                                    anneng 最后由 编辑

                                    https://www.aimspress.com/article/doi/10.3934/microbiol.2020024?viewType=HTML
                                    突变可能造成的影响 这个论文做了一个总结
                                    ca8fd7ec-9dd2-4e70-8986-69fa7eeda9cf-image.png

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                                      anneng 最后由 anneng 编辑

                                      https://www.nature.com/articles/s41598-019-43524-9
                                      Illumina and Nanopore methods for whole genome sequencing of hepatitis B virus (HBV)
                                      524466fb-c8d2-4e12-b6ff-c38928f745a9-image.png

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                                      • A
                                        anneng 最后由 编辑

                                        https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2020.616023/full
                                        Comprehensive Analysis of Clinically Significant Hepatitis B Virus Mutations in Relation to Genotype, Subgenotype and Geographic Region
                                        使用公开数据分析HBV的突变
                                        Table_1_Comprehensive Analysis of Clinically Significant Hepatitis B Virus Mutations in Relation to Genotype, Subgenotype and Geographic Region.XLSX

                                        这个表格的格式可以作为分析的模板
                                        行是样本 列是突变的位置或者重要图标的代号

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                                        • A
                                          anneng 最后由 编辑

                                          https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/ENTROPY/entropy.html

                                          香农熵计算器

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                                          • A
                                            anneng 最后由 编辑

                                            https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/.
                                            结构预测

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