导出数据：
sqlite> .headers on
sqlite> .mode csv
sqlite> .output data.csv
sqlite> SELECT customerid,
...> firstname,
...> lastname,
...> company
...> FROM customers;
sqlite> .quit

https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.11.20.20227355v1.full
参考文献

https://www.openhumans.org/

The input file appears to be unsorted. Please sort by chromosome and by location and re-submit

--no_check_variants_order

svtools vcfpaste
-m merged.vcf
-f cn.list
-q
| bgzip -c \

merged.sv.gt.cn.vcf.gz

IOError: [Errno 24] Too many open files: '../cn/ZGSP-9.vcf'
ulimit -n 2048 扩大文件限制

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https://www.jieandze1314.com/post/cnposts/scrna-6/
工作原理第一步：微珠上DNA引物设计
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先预制凝胶微珠，也就是所说的gel beads，然后每个凝胶微珠"种上"特定的DNA片段，每个DNA序列分成几段：

第一段是barcode，16bp碱基，大约350万种barcodes，一个微珠对应一个barcode，利用这么多barcode可以区分各个凝胶微珠。=》每个凝胶微珠的ID号

其中任意两个barcode之间至少差两个或者两个以上的碱基，因为测序存在对碱基的误读，这样设计可以避免将两个barcode搞混(可以试想，如果两个barcode之差一个碱基，那么就有16分之一的概率将两个判断成一个)

第二段是UMI序列，即unique molecular index，它是一段随机序列，也就是说每个DNA分子都有自己的UMI序列，UMI长为10bp，那么就有4^10=1,048,576也就是100多万种变化。它的作用就是经过了PCR+深度测序后，找到reads与原始cDNA的对应关系 =》 每个DNA标签分子的ID号

它考虑到了这样一种情况：一个基因片段经过PCR扩增产生多个reads，但是不加标记我们是不知道的，并且不同基因的PCR扩增效率可能不同，因此一个基因最后得到的reads数就可能由于PCR扩增效率高而超过了另一个基因(而这两个基因的真实表达量可能差不多)。也就是排除"PCR bias”

第三段是Poly(dT)序列，它起到的作用是与mRNA的poly(A)尾巴结合，作为逆转录的引物，将cDNA逆转录出来
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工作原理第二步：芯片的液流管路
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细胞混悬液在第一个十字交叉口，与凝胶微珠混合；接着进入第二个交叉口，这时加上油滴，把凝胶微珠+细胞混悬液包裹起来=》油包水的小液滴=》这些油包水的小微滴就组成了乳浊液

乳浊液中，有的是包含一个细胞的(红圈部分)，也有的不包含细胞，还有的有两个以上细胞(这个叫"Doublets”) ，一个小液滴中包含几个细胞是符合"泊松分布"的。

大部分细胞会匹配到一个小液滴中(细胞混悬液中大约有65%的细胞可以被成功包到有微珠的小液滴中=》也叫做细胞的捕获效率~65%)，后续分析的reads就是从它们这里来的
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工作原理第三步：测序文库构建
得到乳浊液后，就要脱掉细胞膜，让其中的mRNA游离出来=》

游离出来的mRNA与小液滴中的水相混合，水相中包括凝胶微珠上连着的核酸引物、逆转录酶、dNTP底物，发生逆转录反应=》

通过mRNA的polyA与凝胶微珠上的polyT互补，mRNA与凝胶微珠上带有标签的DNA分子结合起来，然后在逆转录酶作用下，逆转录出cDNA=》

这样得到的cDNA分子是带有微珠特定的barcode标签的，并且每个cDNA分子带有特定的UMI标签，有了这两个标签，就可以区分这个特定的cDNA与其他的cDNA=》

然后将乳浊液中所有的水相抽出来，也就是把带有标签的cDNA分子抽出来=》

cDNA分子加接头，PCR扩增，得到illumina文库
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数据构成
一个样本一般就测几百或几千细胞，barcode种类却有3百多万，所以很少出现一个barcode对应两个细胞的情况。因此得到的数据可以通过barcode拆分，将测序reads回溯到每个细胞

当然，是有可能出现一个barcode对应两个甚至多个细胞的情况，这时如果按照barcode去拆分，就会将这两个或者多个细胞的reads组合成一个**“pool**"。因此，为了减少pool的出现，就要在细胞混悬液制备阶段，控制原始的细胞数量

所以这里看到，并不是制备的细胞数越多越好。原始细胞数越少，最后的混合pool就越少，这也是符合泊松分布的。一般来说一个样本混悬液的细胞数在1万以下比较好

利用UMI对reads进行简并，就可以看到细胞reads与基因数量之间的关系，比如这样：横坐标是细胞reads数，纵坐标是基因数，reads数越多能得到的基因也就越多。一般来说一个细胞读到30万条reads后，基因数量随reads数增加的速度会变慢=》基因数量”平台期”

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一般一个细胞可以得到4万-8万个有效的UMI，平均一个细胞的一个基因有10个UMI；

一个细胞的一个基因的表达量是衡量这个细胞的一个维度，于是几千个被测基因的表达量形成了几千个维度。如果将成千上万个细胞放在一起分析，经过降维、聚类，放到一个三维空间并加上颜色，就形成了这样的分布形式

10x中有好几个标签，需要区分下：

Question: How does Cell Ranger correct for amplification bias?
Answer: Each transcript captured in the Single Cell 3' and V(D)J assay is labeled with a 10-12 bp Unique Molecular Identifier (UMI) in addition to a 16 bp cell barcode. After sequencing, the UMI is used to distinguish sequenced reads that originate from unique mRNA molecules vs PCR duplicates.
Multiple reads that match the same UMI, 10x barcode and gene are collapsed to a single UMI count in the gene-barcode UMI count matrix.

For more information please see: Gene-Barcode Matrices.

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https://www.biorxiv.org/content/10.1101/065912v1.full

https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12859-020-03704-1#availability-of-data-and-materials
Evaluation of variant calling tools for large plant genome re-sequencing
这个文章推荐的流程是bwa samtools/mpileup

https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12859-020-03704-1

Evaluation of variant calling tools for large plant genome re-sequencing

https://www.biostars.org/p/240965/
./.　表示没有数据no call

Scanpy用的是PAGA 相关论文如下：
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-019-1663-x
和Scanpy一样　PAGA也是　theislab　实验室出品的方法　
https://github.com/theislab/paga

https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial-reclustering
可以设置不同的过滤条件和阈值进行聚类。
这些不同的聚类结果应该保存成不同的成果，这些成果可以删除或者查看。